Introduktion
PCR är en förkortning av engelskans Polymerase Chain Reaction och är en metod för att tillverka många kopior av en DNA-sekvens in vitro. På svenska kallas det ibland för polymeraskedjereaktion. En PCR föregår ofta andra genetiska analyser eftersom det är lättare att t.ex. sekvensbestämma DNA som finns i tusentals kopior istället för några få.
DNA kopieras även in vivo strax varje gång en cell delar sig. Det kallas för replikation och är en förutsättning för att alla celler i en kropp ska ha samma genetiska information, och för att avkommor ska ärva föräldrars genetiska material. Man kan säga att PCR-metoden är en efterhärmning av cellens kopieringsmaskin.
Så här går det till:
Olika komponenter blandas till en reaktion som startar när blandningen genomgår upprepade temperaturcykler. Själva PCR-maskinen som sköter cyklerna kallas just för en termocykler. Reaktionen som resulterar i hundratusentals kopior av en DNA-sekvens tar några timmar.
Komponenterna till reaktionen blandas
- DNA templat kallas den mall som används vid för tillverkningen av kopior. Det är DNA som isolerats från ett biologiskt prov, t.ex. blod eller saliv från den individ som ska analyseras.
- Primers kallas de korta bitar av DNA som binder komplementärt till var sin sida (5’och 3′) av den DNA-sekvens som ska kopieras. Ett primerpar designas digitalt inför en ny PCR så att de endast binder till den DNA-sekvens som ska kopieras och inte någon annanstans i genomet.
- Fria nukleotider i form av deoxynukleotider (förkortas dNTPs) som är byggstenarna i de nya DNA-sekvenserna. dNTP en mix av dATP, dTTP. dGTP och dCTP. Under reaktionen frigörs byggstenarna adenin (A), tymin (T), guanin (G ) och cytosin (C) ur dessa.
- Det värmetåliga enzymet DNA-polymeras är själva motorn i reaktionen och sammanfogar de fria nukleotiderna till nya kopior av den del av DNA-sekvensen som pekas ut av primerparet.
Reaktionen startar i en termocykler
Blandningarna placeras i en termocykler och ett ”PCR-program” startas med upprepade uppvärmningar och nedkylningar. Programmen ser lite olika ut, framförallt temperaturen vid hybrideringssteget kan variera beroende på primerparets sammansättning (t.ex. hur många G och C).
Denatuering (94-100 grader C)
De två strängarna i DNA-spiralen separeras för att tillgängliggöra DNA-sekvensen för primers och DNA-polymeras.
Hybridisering (50-68 grader C)
De två primers som används fäster vid sidorna av det DNA som ska kopieras. Temperaturen varierar och beror på primerparets sammansättning.
Elongering/Förlängning (72 grader C)
DNA-polymeras tillverkar nya kopior av DNA-sekvensen och använder primers som startposition. Byggstenarna är fria nukleotider (dNTPs).
Temperaturcykeln upprepas 25-40 gånger och de nya kopiorna fungerar som nya templat. Till slut har miljontals kopior av samma DNA-sekvens tillverkats som kan analyseras vidare, exempelvis kan det sekvenseras.
Uppdaterat: 2024-06-24
