Genomredigering kallas ibland för genredigering eller geneditering, men eftersom det inte är bara den delen av genomet som består av gener som kan redigeras, så är genomredigering en mer inkluderande term.
CRISPR/Cas9-tekniken i korthet
CRISPR/Cas9 är en teknik för genomredigering och kan användas för att ändra (redigera) genomet (arvsmassan) i celler hos nästan alla slags organismer. Tekniken består av två komponenter: ett guide-RNA och enzymet Cas9. Ett guide-RNA är på förhand konstruerat att binda till (baspara) en specifik DNA-sekvens i genomet, till exempel en gen man vill redigera. Cas9 klipper itu den DNA-sekvensen som guide-RNA binder till. En ny mutation kan uppstå i snittet när cellens reparationssystem lagar skadan i DNA-sekvensen.
Läs i stycket CRISPR/Cas9-tekniken steg för steg hur det går till i detalj.
Från bakterier till Nobelpris
Ett avancerat försvarssystem
Förlagan till CRISPR/Cas9 finns naturligt hos vissa bakterier där det fungerar som ett försvar mot virus. De virus som attackerar bakterier kallas för fager, eller bakteriofager. En försvarsmekanism som finns hos bakterier är att nukleaser, till exempel Cas9, klipper sönder virusets DNA.
En liten snutt DNA från varje virus som infekterat bakterien sparas i en genetiskt bibliotek hos bakterien. Biblioteket kallas för CRISPR och är en akronym av Clustered regularly interspaced short palindromic repeats. Den lilla snutten virus-DNA som kallas för spacer (S) och omges i bakteriens genom av repeats (R) som är palindrom. I närheten av biblioteket finns flera gener som kodar för Cas9.
—-BILD—-
Varje spacer transkriberas i bakterien från DNA till ett så kallat crisprRNA (crRNA) som fungerar som en igenkänningsmolekyl. I ett första skede bildas pre-crRNA som fångas upp av Cas9 och mognar till crRNA.
—-BILD—-
Nästa gång samma sorts virus infekterar bakterien så känns det igen vilket leder till att Cas9 klipper sönder och oskadliggör viruset. Cas9 cirkulerar i bakterien med olika minneskort av virus-DNA i jakt på inkräktare.
—–BILD—-
För att Cas9 inte ska klippa sönder bakteriens eget DNA (minneskorten som finns i CRISPR-biblioteket) så finns det en markör som flaggar för virus-DNA. Markören kallas för PAM och finns i virusets men inte i bakteriens DNA. Andra nukleas har andra markörer, men för Cas9 är PAM tre nukleotider, som ibland skrivs ut ”NGG”. Det betyder att ”N” kan vara vilken nukleotid som helst (A, T, C eller G) som efterföljs av två G. Cas9 klipper itu DNA-spiralen tre nukleotider uppströms om PAM.
—BILD—???
Tillblivelsen av en revolutionerande teknik
Forskarna Jennifer Doudna och Emmanuelle Charpentier översatte den här försvarsmekanismen hos bakterier till en teknik för genomredigering. De ”upptäckte” inte CRISPR/Cas9 men såg potentialen och hittade de nycklar som krävdes för att få gensaxen att fungera utanför bakterien. Doudna och Charpentiers samarbete såg ungefär ut så här:
Emmanuelle Charpentier studerade Streptococcus pyogenes, en bakterie som kan attackera blodceller och ge upphov till sjukdom och död. Hon upptäckte i bakterien en tidigare okänd molekyl, tracrRNA, som visade sig vara en del av CRISPR/Cas9. Ett tracrRNA kopplat till ett crRNA utgör tillsammans den igenkänningsmolekyl som leder Cas9 till virus-DNA. Charpentier publicerade upptäckten 2011.
Jennifer Doudna är en erfaren biokemist med stor kunskap om RNA. Samma år som Charpentier publicerade upptäckten om tracrRNA inledde de två ett samarbete. Tillsammans lyckades de få CRISPR/Cas9 att fungera även utanför bakterien, i ett provrör, och de förenklade de molekylära komponenterna så att den blev lättare att använda. De kopplade till exempel ihop tracrRNA och crRNA till en enda RNA-molekyl som de namngav guide-RNA.
I ett epokgörande experiment programmerade de om CRISPR/Cas9 som i sin naturliga form känner igen DNA från virus. Charpentier och Doudna visade att det går att styra den så att den klipper av vilken DNA-sekvens som helst- i nästan vilken organism som helst. Klippet sker dessutom på ett förutbestämt ställe vilket gör att man med CRISPR/Cas9 kan inducera riktade mutationer och till exempel kan stänga av specifika gener. År 2020 fick de Nobelpriset i kemi för att ha utvecklat CRISPR/Cas9 till en specifik gensax.
CRISPR/Cas9-teknikens aktörer
Cas9 är ett nukleas som klipper i DNA. Det har lite förenklat två aktiva delar, en helikas-del som kan öppna upp den dubbla DNA-strängen, och en nukleas-del som klipper av den.
Ett guide-RNA är en 20 baser lång RNA-sekvens som är konstruerad så att det basparar med en specifik DNA-sekvens.
—BILD PÅ CRISPR/Cas9—-
CRISPR/Cas9-tekniken steg för steg
Det första CRISPR/Cas9 söker efter är en PAM i DNA-sekvensen.
—BILD—
När Cas9 hittar en PAM använder det sin helikas-del för att öppna upp den dubbla DNA-strängen och guide-RNA:t försöker baspara.
—BILD—
Alla 20 basparen av guide-RNA:t måste baspara med DNA-sekvensen annars släpper Cas9. Om guide-RNA:t matchar så använder Cas9 sin nukleas-del som klipper av båda DNA-strängarna.
—-BILD—-
När DNA-strängarna skadas aktiveras cellens reparationssystem, men lagningen blir inte alltid perfekt och en mutation kan uppstå. Det finns två olika reparationsmekanismer som kan leda olika typer av mutationer.
Den vanligaste för DNA vid dubbelsträngsbrott är icke-homolog sammanfogning (eng. non-homologous end-joining, NHEJ). Den här typen av reparation kan äga rum när som helst under cellcykeln och sammanfogar bara direkt de avbrutna DNA-strängarna. Mutationen som kan uppstå kallas en indel vilket innebär att en eller ett par baser läggs till (insertion) en försvinner (deletion).
Den andra reparationsmekanismen kallas homologistyrd reparation (eng. homology directed repair, HDR) och är betydligt mindre frekvent. Här ges tillfälle att föra in en ny DNA-sekvens, så att resultatet av reparationen blir möjlig att styra. Homologistyrd reparation kan bara ske under visa faser av cellcykeln (G2 och S-fasen) så det gäller att optimera förhållandena i cellen samt tillsätta donator-DNA.
—NY BILD—
Problem som kan uppstå
Det händer att Cas9 ignorerar några fel-matchningar när guide-RNA binder till DNA-sekvensen, vilket ger upphov till oavsiktliga redigeringar, så kallade off-targets.
Andra CRISPR/Cas-system
Ungefär 50 % av alla bakterier, och 90 % av arkeér verkar ha någon form av CRISPR/Cas-system. CRISPR/Cas9 har utforskats och använts flitigast och har sitt ursprung i bakterien Streptococcus pyogenes – men det finns fler. CRISPR/Cas12a kommer från bakterien Francisella novicida och skiljer sig från CRISPR/Cas9 på flera sätt. Det har till exempel en annan PAM-sekvens och ett mindre guide-RNA (endast crRNA och inte tracrRNA). Ett annat exempel är CRISPR/Cas13 som finns naturligt i bakterien Leptotrichia shahii och som klipper i RNA istället för DNA. Nya nukleas och CRISPR/Cas-system med andra egenskaper än CRISPR/Cas9 upptäcks kontinuerligt av forskare och verktygslådan utökas hela tiden med uppdaterade tekniker.
Andra gensaxar
De första gensaxar som utvecklades kom på 1990-talet och baseras på enzymer som heter meganukleaser och zinkfingernukleaser (ZNF). Efter 2009 började även gensaxen TALEN användas och under det senaste decenniet har CRISPR/Cas9 totalt dominerat.
Huvudrollen vid all genomredigering spelas av den grupp enzymer som heter nukleaser. Deras specialitet är att de kan klippa av den dubbla DNA-spiralen. Om enzymerna klipper av DNA-spiralen i en levande cell så aktiveras cellens reparationssystem som lagar skadan. DNA-spiralen klistras ihop igen men ofta förändras DNA-sekvensen i snittet och en eller ett fåtal baser försvinner eller tillkommer. En mutation har då uppstått. Det går alltså att använda nukleaser för att inducera mutationer.
Riktigt användbara blir nukleaserna om det går att styra var i genomet de klipper och därmed var mutationen uppstår. Det kallas för att rikta mutationer och det är precis det som gensaxar används till. I en gensax sitter ett nukleas ihop med en annan molekyl som fungerar som vägvisare. Molekylerna som visar vägen är olika för olika gensaxar. För CRISPR/Cas9 är det till exempel ett guide-RNA som styr enzymet Cas9.
Meganukleaser
Meganukleaser är kompletta gensaxar som finns naturligt hos bakterier men även hos en del alger, jästsvampar och ett fåtal växter. De består av en del som känner igen och binder till en specifik DNA-sekvens, och en enzym-del som klipper itu samma sekvens. Flera hundra meganukleaser har upptäckts och renats fram, men de används inte i samma utsträckning som andra gensaxar. Anledningen är att det har varit svårt för forskare att programmera om dem så att de binder till andra DNA-sekvenser än sina ursprungliga. Det innebär att antalet platser i genomet som kan redigeras är begränsade.
ZNF och TALEN
ZFN och TALEN är båda gensaxar som satts ihop på konstgjord väg. Likt meganukleaser består de av två delar, en del som binder till DNA och en enzym-del som klipper itu DNA-spiralen. För varje ny genomredigering som en forskare vill göra så måste den DNA-bindande delen designas om för det specifika ändamålet. Sedan måste den delen sättas ihop med enzym-delen. ZNF och TALEN är mycket användbara gensaxar men något mindre flexibla än CRISPR/Cas9.
Utvecklingar av CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9 är en ung metod och utvecklats hela tiden vidare främst eftersom nya enzymer upptäckts som har andra egenskaper än Cas9. Till exempel så kan Cas13 och Cas7-11 användas för att klippa i RNA istället för DNA. Det kommer väl till pass för forskare som studerar virus vars genom består av RNA och inte DNA. Ett sådant virus är sars-cov-2 som orsakar covid-19.
Ett annat enzym som heter Cas3 gör inte bara ett klipp i DNA-spiralen utan raderar en lång DNA-sekvens. Det kan vara användbart för forskare som studerar outforskade delar av genomet som inte innehåller gener. Vad händer när en region på en viss kromosom tas bort? Försvinner någon funktion?
Ytterligare en utveckling av gensaxen CRISPR/Cas9 är verktyget ”CRISPRoff” som kan stänga av och sätta på gener. I CRISPRoff är Cas9 utbytt mot ett protein som fäster en metylgrupp (CH3) intill en gen vilket gör att genen stängs av. Om metylgruppen sätts på igen så aktiveras genen åter. Du kan läsa mer om hur geners aktivitet, så kallat genuttryck, regleras med hjälp av bland annat metylgrupper i det här avsnittet.
I länkarna nedanför kan du läsa mer om hur genomredigering används:
- I USA finns ett marknadsgodkänt nötdjur som fått en egenskap förändrad med CRISPR/Cas9. Djuren har kortare päls och klarar därmed hetta bättre.
- CRISPR/Cas9 har använts av ett svenskt företag för att ta fram en potatis med förändrad sammansättning av stärkelse.
- Den första CRISPR-baserade genterapin som testats i patienter är säker och ger positiv behandlingseffekt.
- Japan har godkänt en genomredigerad fisk och två sorters tomater som livsmedel.
- I olika forskningsprojekt med djur har virusresistenta grisar, hornlösa kor och sterila laxar tagits fram och från växtriket stadsanpassade tomater och champinjoner som inte mörknar.
Uppdaterades 2023-05-23
